Q&A: 轻松掌握Primer5 入门级引物设计全攻略
Primer5作为一款强大的引物设计软件,广泛应用于分子生物学实验中。无论是初学者还是有一定经验的科研人员,都可以通过Primer5设计出高效、特异的PCR引物。以下是一份详细的Primer5入门级引物设计攻略,帮助大家快速上手这款软件。
一、准备工作
1. 安装Primer5
首先,你需要在你的电脑上安装Primer5软件。你可以从官方网站下载最新版本,并按照安装向导进行安装。
2. 查找目的基因的mRNA序列(或cDNA)
在开始设计引物之前,你需要获取目的基因的mRNA序列或cDNA序列。这可以通过以下几种方式实现:
实验室已有的某物种基因组数据库中查找:如果你所在的实验室有自建的基因组数据库,可以直接在其中查找。
NCBI上查找:这是最常用的一种方法。进入NCBI官网,选择Nucleotide,然后在搜索框中输入基因名和物种名(拉丁学名),点击搜索。注意,有时你可能无法直接找到该物种的目的基因,这时可以尝试先找到与该物种亲缘关系相近的目的基因,下载该序列,再利用NCBI上的BLAST工具进行序列比对。
二、设计引物
1. 打开Primer5并导入序列
安装并打开Primer5软件,点击File-New-DNA sequence,在弹出的窗口中粘贴你的cDNA序列,点击As is,然后点击OK。
2. 设计引物参数设置
点击Primer,然后点击Search,在弹出的窗口中调整参数。以下是常见的参数设置:
产物长度:产物长度可以自行调整,一般包括整个目的序列。
引物长度:一般为18-30bp,视情况调整。最常用的是18-24bp,最短不要少于15bp,最长不要超过30bp。
点击OK,会弹出一个新窗口,继续点击OK。这时,Primer5会根据你设置的参数开始搜索引物。
3. 筛选引物
在搜索结果窗口中,你可以看到系统为你设计的多对引物。这些引物会按照评分(Rating)从高到低排序。评分高的引物通常具有较好的特异性和扩增效率。
以下是一些筛选引物的原则:
上下游引物评分:sense(上游引物)和anti-sense(下游引物)的评分最好都是None,评分越高越好。
ΔG绝对值:ΔG绝对值小于10。
Tm值:Tm值一般在55-70℃之间,最好在60℃左右,正负1度。
GC含量:GC含量应在40%-60%之间。
引物末端:末端不能是A,不能有连续3个相同的碱基,3’端一定不能有错配,5’端不要是G。
二级结构:最好没有hairpin(发夹结构)、dimer(二聚体)和false priming(错误引发)。
由于基因序列本身的差异,很难调到所有原则都满足,但可以对系统给出的引物中的前几对进行调整,尽可能满足以上原则。
4. 调整引物
以系统给出的第一对引物为例,虽然系统给出的评分比较高,但下游引物可能出现发夹结构和二聚体,这时可以尝试调整一下。
调整引物位置:点击左上角的A(Anti-sense),当图示的引物与A的颜色一致时,表示展示的是Anti-sense。然后把鼠标的光标放在引物的位置左右滑动,调整上下游引物位置。
删除或添加碱基:点击3’端,序列的位置会跟着移动。如果需要更改默认长度,点击左上角File>preference。点击Edit Primers,即可删除多余的碱基或添加新的碱基。注意编辑引物时,只能从右边添加或删除碱基,如果想在左边添加或删除,需要通过左右移动碱基的位置。
例如,如果某对引物的GC含量过高,可以尝试删除5’端的一个C,降低GC含量。首先把光标放在引物的位置,将引物向后移动一个,观察引物向后移动了一个碱基,长度增加了,此时点击Edit Primers,删除几个碱基后点击Analyze(分析)。
三、导出引物
当你找到满意的引物后,可以将其导出。首先,打开一个Excel文件,然后在Primer5中点击Edit-copy-sense primer,粘贴到Excel中;再点击Edit-copy-Anti sense primer,粘贴到Excel中。
四、注意事项
1. 产物长度:产物长度最好大于100bp,小于300bp,也可以到400bp。如果产物长度太短,琼脂糖凝胶电泳时条带会很模糊。
2. 搜索参数:Search parameters可以选择Manual,Search stringency应选High。如果没有特殊要求,
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